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如何突破抗體生產瓶頸

瀏覽次數: 日期:2020-03-04 09:24:59
導讀
在全球和中國醫藥市場上,抗體藥物已連續多年占據銷售榜單前幾位。當前,隨著國家醫改政策的改革和完善,國際、國內市場打通,抗體市場也開始進入“你方唱罷我登場”群雄逐鹿的競爭階段,生產企業如何在確保產品質量的基礎上,通過改進工藝,來降低成本、提高生產效率和市場競爭力?江博士文章給讀者提供了一條切實可行的思路和方法,請看“如何突破抗體生產瓶頸”。
 
抗體藥物市場及發展趨勢
全球生物制藥產業發展迅猛,根據Frost&Sullivan市場調研,2018年全球生物制藥市場規模約為2642億美元。單抗類藥物由于特異性好,靶向性高,副作用小,療效顯著成為發展最快的一類生物藥。單抗藥物在全球生物藥中所占市場份額超過50%,達到1353億美金。
 
中國巨大的市場潛力,國際重磅抗體藥專利到期,大量的海歸人才回流及中國日益強大的資本助力,都為中國抗體制藥發展提供了前所未有的歷史機遇。但是中國抗體制藥企業也面臨巨大的挑戰。首先中國藥企無論是技術、規模、經驗,人才還是資金,跟國際生物制藥巨頭相比,都有著較大的差距。其次中國加入ICH和國際藥監管體系接軌,降低藥品進口關稅,對進口抗癌藥物實施零關稅等系列政策,降低了國外原研藥進入中國市場的門檻,給中國生物藥企業帶來了巨大壓力和挑戰。另外,越來越多的制藥企業進入抗體藥的開發領域,每個重磅抗體藥物基本上都有幾十家企業在仿制研發申報,因此國內抗體藥企不僅要面臨國外原研藥巨頭的打壓,還要面對國內眾多同行及印度廉價藥企業激烈的競爭。最后帶量采購新政允許通過一致性評價的仿制藥與原研藥可以一起同臺競標,低價中標,消除了銷售渠道的壁壘使得國內外生物藥企的競爭回歸到技術創新,產品質量和成本的競爭。 因此國內生物藥企是否能在激烈的競爭中取得優勢取決于其生產工藝的先進性,因為制藥工藝水平決定了產品的質量和成本。
 
抗體藥物的生產工藝進展
抗體藥物生產是個非常復雜的過程,大致分為上游的發酵及下游的分離純化:上游工藝主要包括細胞復蘇、傳代、發酵生產。而下游工藝主要包括膜過濾及多步層析分離純化。過去十多年來,基因工程獲得突飛猛進的進步,細胞培養的表達量從原來的不到0.5 g/L 到現在普遍達到5g/L,有的甚至超過10g/L。這些進步是由細胞表達載體的開發,克隆篩選以及細胞培養基優化等技術創新所驅動的。由于發酵產率的大幅度提升,使得上游細胞培養成本大幅度降低(表1)。
表達量與抗體生產成本關系
表1表達量與抗體生產成本關系
 
與上游十多倍生產效率提升相比,下游分離純化技術進步明顯滯后,導致下游工序成為生產瓶頸,抗體主要生產成本也轉移到下游。下游工藝在整個生物制藥生產中占據60%以上生產成本,也被認為是最需要改進的技術領域。下游工藝先進性決定了藥品的質量,及藥品生產效率和成本,也成為生物制藥企業的核心競爭力所在。生物制藥下游生產工藝目的就是把目標藥物分子從復雜發酵液體系中分離出來以滿足藥品純度及質量的需求。一方面監管部門對生物藥的純度和質量要求越來越高,另一方面生物分子具有結構復雜,且對外部條件敏感,穩定性差,雜質多,濃度低等特點,使得生物藥分離純化的挑戰更大。比如說治療用抗體不僅對含量有嚴格的要求,還必須去除各種潛在的雜質如宿主HCP, DNA,Endotoxin, 抗體聚集體及降解片段等(表2)。
表2 抗體藥物對各種雜質的要求
 
層析技術具有分離純化效率高,條件溫和且容易保持目標分子的生物活性,因此成為生物制藥分離純化最主要工具。但下游層析分離純化技術牽涉到材料、生物、化學及設備等交叉技術領域。因此研究下游分離純化技術的人才較少,另外上游基因工程技術幾乎在所有高校都有專業研究團隊,而且培養了大量的人才,而下游分離純化技術卻很少在高校有專門研究,也缺乏相關的專業課程來培養分離純化的人才。過去10多年上游基因工程的迅猛發展雖然帶來上游發酵成本的大幅度下降,但下游分離純化技術進步緩慢使其成本居高不下。因此要降低抗體生產成本關鍵就是要解決下游分離純化的瓶頸問題。
 
抗體的層析分離步驟基本都可以采用標準化的三步曲:第一步用Protein A介質進行抗體捕獲和濃縮;第二步用離子交換進行中間純化以去除多聚體,宿主蛋白等雜質;第三步是精純去除剩余DNA,Endotoxin,Protein A 等微量雜質。在這三步抗體的分離純化過程中,第一步的Protein A親和捕獲占據分離純化成本80%以上,也是下游分離純化的瓶頸所在。親和層析之所以成本高的主要原因:首先是Protein A 價格昂貴,其價格是普通層析介質十幾倍;第二,Protein A使用壽命短,一般離子交換填料使用壽命多達1000次,而親和填料壽命通常在100-200次;第三,Protein A 用于抗體的捕獲和濃縮,需要處理大體積的發酵液,而親和步驟載量往往又低于陰陽離子交換層析,使得親和層析介質使用量比中間純化或精純的要多得多。因此,要降低抗體的生產成本,解決抗體的生產瓶頸關鍵在于改進第一步Protein A 親和捕獲。
 
下游分離純化核心的工藝流程
 
Protein A 親和層析是利用Protein A 配基與目標抗體具有專一親和吸附作用從而達到分離純化抗體的目的。野生型Protein A蛋白是金黃色葡萄球菌細胞壁錨釘蛋白。三維空間上,抗體FC端CH2-CH3區域與Protein A蛋白B結構域上兩條反相平行的α螺旋結構相互結合。因此Protein A與抗體分子特別是與IgG1、IgG2、IgG4有特異性結合,使得抗體分子與發酵液中不具FC端結構的雜質如宿主蛋白與核酸等有效分離,進而達到純化目的。Protein A 親和層析介質是通過把ProteinA 配基偶聯到微球介質上制備而成的。因為Protein A配基與目標抗體的作用的專一性,因此親和層析的分離純化工藝和方法與抗體樣品雜質含量和種類多少影響不大,使用Protein A 介質一步純化目標抗體就可以達到95%以上純度,回收率達到90%以上。親和純化效率也基本不受雜質多少影響,而其它分離模式如離子交換,疏水,分子篩等的分離工藝方法及效率大多取決于與目的蛋白同時存在的雜質種類和含量。因此,只要樣品雜質不同,即使是純化同樣的目標生物分子,采用的分離工藝和方法就不同。以重組胰島素分離純化為例,不同廠家雖然生產的是同一目標胰島素,但采用分離純化方法完全不一樣,主要原因就是每家生產的胰島素雜質組成和含量不一樣,因此需要不同的純化工藝。而比胰島素分子量更大,結構更復雜的抗體基本可以采用標準化的三步曲,主要原因就是Protein A 親和介質的出現大大簡化抗體的分離純化工藝,但Protein A 價格昂貴讓抗體生產廠家愛恨交加。 Protein A 介質價格高的主要原因是其生產工藝復雜,ProteinA 配基是通過生物發酵生產的,經過純化后偶聯到介質上成為Protein A 親和介質,因此生產成本遠高于傳統的離子交換、疏水、分子篩等介質。另一方面Protein A產品主要由歐美幾家供應商壟斷,也是價格居高不下的原因之一。為了降低抗體生產成本,不少研究工作者在尋找可以取代Protein A且價格低廉的新型層析介質來純化抗體,雖然可能在一些個案中獲得成功,但都無法撼動Protein A 在整個抗體分離純化的壟斷地位。ProteinA 親和層析成為過去近30年里抗體純化捕獲的金標準。因此要降低抗體親和層析這一步的成本首要的方案是實現Protein A 介質的國產化以降低產品價格;其次是通過采用創新的連續層析工藝技術或其它新工藝以提高Protein A 介質的利用率并提高抗體生產效率。當然不斷改進Protein A 介質性能使其具有更高的載量和更長的使用壽命也可以降低抗體的生產成本。
 
Protein A 介質國產化創新之路
目前市場上主流Protein A產品是GE生產的以瓊脂糖為基質的產品,也是最早商業化的產品。瓊脂糖為基質的Protein A 介質具有載量高,親水性能好,非特異性吸附低等優點,但瓊脂糖介質天然缺陷是機械強度差,因此也被稱為軟膠。由于該介質耐壓性能差,生產中需要降低柱高、減小流速以防止壓力過高造成柱床塌陷,限制了抗體批處理量及抗體生產效率。軟膠Protein A 另外一個缺陷是傳質速度慢,主要原因是軟膠孔徑較小,排阻大。因此軟膠Protein A 都需要駐保留時間長,流速慢條件下,抗體吸附載量才會比較高,但在高流速下動態載量下降的非常快。因此一個理想的抗體純化用Protein A 介質需要具有高流速,高載量,高機械強度,及更長的使用壽命等特點。Protein A 介質載量是由微球孔徑,比表面積,配基密度來決定的;機械強度則是由Protein A基球材料化學組成,交聯度及孔隙率來決定的;Protein A 配基脫落及使用壽命主要由配基,基球性能及偶聯方式來決定。實現高性能Protein A 親和介質的國產化需要從底層創新開始。
 
抗體結構示意圖
 
創新之一:單分散基球替代多分散基球    層析介質粒徑大小和粒徑分布是影響層析分離的重要參數。粒徑分布越均勻,裝柱越容易、柱床越穩定、柱效越高、流速越均勻、洗脫越集中、分離效率越高、流動相用量越少,柱與柱重復性也越好;Protein A 介質被譽為層析介質皇冠上的明珠,價格昂貴,可是市場上Protein A 介質都是采用粒徑分布較寬的基球。主要原因是單分散微球制備技術難度極大,世界上可以規模生產的單分散多孔微球只有Dynal公司一家,GE銷售的SOURCE 系列單分散聚苯乙烯色譜填料就是Dynal生產的。但SOURCE 產品的粒徑最大只有30微米,不能滿足Protein A 介質對粒徑一般要大于40微米的要求。納微經過多年的努力開發出世界領先的微球精準制備技術,突破大單分散大粒徑多孔微球的制備難題,成為全球第一家生產單分散Protein A 親和層析介質的公司。
 
納微單分散Protein A介質與傳統軟膠基質微觀結構對比
 
傳統多分散Protein A親和軟膠與UniMab液流路徑對比示意圖
 
創新之二:通透大孔徑基球微替代小孔微球
Protein A 基球孔徑大小會影響生物分子在介質的傳質速度和有效載量,孔徑越大,分子傳質速度越快,在高流速下具有高載量。基于軟膠基質的GE Protein A親和介質孔徑較小,比表面積高,其靜態吸附載量高,但傳質阻力大,在駐留時間短,流速快的條件下,動態載量下降的很快。納微經過優化篩選,專門設計的大孔結構基球,其孔徑達到GE Protein A 介質的一倍左右。因此該介質傳質速度快,使得介質在高流速下具有高載量。從實驗測試數據可以看到,納微UniMab與GE MabSelectSuRe在駐留時間大于4分鐘時,載量都差不多,當駐留時間小于2分鐘時UniMab的載量比MabSelectSuRe載量高50%以上, 而且速度越快UniMab載量優勢越明顯。抗體生產效率是由動態載量和流速共同決定,流速越快載量越高,生產效率越高,成本越低,但親和層析介質的動態載量與流速成反比,流速越快,載量越低,因此對于每個Protein A親和介質純化抗體效率都會隨著流速升高效率逐步提高,到了一個最優的流速后,如果繼續增加流速,純化效率反而降低。林東強教授實驗證明對于批次親和層析,駐留時間是2分鐘時生產效率達到最高,而駐留時間在2分鐘條件,UniMab的動態載量比MabSelectSuRe 高50%以上。對于連續層析駐留時間是1分鐘時生產效率最高,而這個保留時間,UniMab的動態載量更是MabSelectSuRe一倍以上。另外從抗體流穿曲線對比圖也可以看出具有大孔結構及高度粒徑均勻性的單分散Protein A親和層析介質與多分散軟膠PorteinA 介質相比具有更陡的穿透曲線,說明納微單分散層析介質具有更暢通的孔道結構,分子擴散速度快,抗體流穿少,回收率高。因此利用納微大孔結構微球不僅可以提高分子傳質速度,提高抗體生產效率,降低成本,而且在連續層析中,具有更明顯的優勢。
UniMab與MabSelectSuRe產品不同駐留時間動態載量對比
 
不同Protein A 層析介質駐留時間與抗體生產效率與關系對比
 
抗體流穿曲線對比圖
 
創新之三:高度交聯聚丙烯酸酯基球替代軟膠或低交聯的聚丙烯酸酯基球
高機械強度介質不僅可以耐受更高流速、更高壓力、更大粘度樣品,還可以裝更高的柱床,以增加抗體批處理量、提高抗體生產效率、減少設備投資、減少廠房占用面積。因此納微Protein A 介質是選擇高度交聯的聚丙烯酸酯基球,與市場上以瓊脂糖或低交聯度聚丙烯酸酯為基球生產的Protein A 介質相比具有溶脹系數小、壓縮比例低、而且機械性能強。實驗證明 UniMab在2公斤裝柱壓力下,其柱床壓縮比例只有5%,而無論是GE 生產的以瓊脂糖為基球還是Tosoh 生產的低交聯聚合物為基球的Protein A 介質壓縮比例往往超過15%。
 
UniMab與軟膠與壓力流速曲線對比
 
創新之四:表面親水化改性微球替代親水性微球
用于抗體或蛋白純化分離的層析介質必須具有很好的表面親水性,因此市場上主要的Protein A 產品要么是基于親水多糖類材料,或者是用親水單體做的基球,這種基球雖然親水性能好,非特異性吸附低但機械強度差。為了保持基球的機械強度并解決介質親水性問題,納微采用先合成高機械強度高交聯的聚丙烯酸酯微球,然后通過多步表面親水化改性,再進行Protein A配件偶聯。這種方法雖然工藝復雜,但生產的介質既有高機械強度,又有表面親水性能好,非特異性吸附低等特性。因此UniMab在抗體分離過程中,HCP去除效果好, 可以達到軟膠Protein A 的同等水平。
 
納微UniMab與對照填料的HCP去除效果
 
創新之五:Protein A 配基創新
除了基球之外,Protein A 配基也是影響介質性能重要因素,尤其是介質的壽命。GE之所以壟斷Protein A 親和層析介質市場,最主要的是GE擁有耐堿性Protein A 專利技術,其核心專利技術是通過基因工程改變B domain 不耐堿的3個氨基酸以改善其耐堿性能。納微通過優化組合不同片段設計出新序列的Protein A 配基,不僅耐堿性好,而且具有自主知識產權,并能自主實現大規模生產。納微獨有的耐堿性配基加上具有卓越性能的基球,及優化偶聯工藝開發出高性能的Protein A 親和介質。以下是某單抗項目上UniMab介質載量隨使用次數增加的衰減變化表。每個cycle采用0.1M氫氧化鈉CIP,接觸時間1小時。連續200個cycle 后DBC10%依然在初始值的75%左右,充分體現了納微ProteinA介質的良好耐堿性。
納微世界領先的微球精準制造技術,可以對微球的材料組成、粒徑大小、粒徑均勻性、孔徑大小及表面性能達到前所未有的精準控制。納微利用這一技術平臺開發出新一代單分散多孔聚丙烯酸酯為基質的Protein A 親和層析介質克服了傳統ProteinA 軟膠的缺點,也為實現下一代連續層析技術產業化提供理想的介質。
 
Protein A介質創新和生產工藝創新實現抗體生產效率提升
單抗藥物的市場競爭越來越激烈,降低抗體生產成本,高效、穩定的產出合格的產品是每個抗體生產廠家追求的目標。親和層析作為單克隆抗體分離純化的關鍵步驟,關系到下游的主要成本及生產效率,產品質量,也是目前下游生產的主要瓶頸。因此納微通過底層技術創新不僅實現Protein A 介質的國產化,而且克服了現有產品的缺陷,必將大幅度提供抗體生產效率,降低抗體生產成本,更重要的是納微創新性單分散層析介質可以推動下游工藝技術的創新和進步。比如說高機械強度的Protein A 介質就使得通過增加柱床提高批處理量成為可能。而高流速下的高載量及耐高壓特性為最終實現抗體連續層析工藝打下基礎。
 
 
1.高柱床提高抗體批處理量和生產效率
目前GE 生產的Protein A 軟膠占據抗體分離純化的90%市場。由于軟膠機械強度差,耐壓受限(壓力小于3公斤),為了防止柱床塌陷,一般柱床只裝到15cm高度,嚴重限制抗體的生產效率,增加抗體的生產成本。柱床高不僅可以增加抗體的批處理量,提供抗體的生產效率,還可以減少QA及QC等配套人員的工作量,減少純化系統的數量及設備投資。其實,通過高柱床提高生產效率的方法早在成本更加敏感的胰島素、白蛋白、多肽等生物藥生產上成功實現。但要增加柱床高度,Protein A 介質必須具有高機械強度性能,以滿足高柱床高流速下產生的壓力。納微開發的新一代單分散Protein A 介質是以高交聯的單分散聚丙烯酸酯為基質,機械強度高,耐壓性能好。因此柱床可以裝到40cm以上高度,使得抗體批處理量及生產效率可以提高一倍以上,不僅減少設備投資及廠房的占用面積,而且大幅度降低生產成本。另外實驗證明提高柱床還可以提高介質有效載量和利用率,柱床提高一倍,抗體上樣量至少增加2.2倍(見表)。高柱床可以解決因為上游發酵規模的擴大及蛋白表達量的增加而帶來下游分離純化生產瓶頸的問題。另外軟膠放大往往只能通過等高放大,而納微生產的高機械強度Protein A 可以等保留時間放大。
 
傳統軟膠基質只能等高放大(上)和納微Protein A介質可等保留時間放大(下)
 
 
 
表 UniMab對某抗體DBC5%比較
 
 
UniMab在不同柱高下的壓力流速曲線
 
2.連續層析提高抗體生產效率
隨著細胞培養技術的迅猛發展,蛋白表達量不斷增加以及新興的連續灌流培養技術的發展對下游純化效率提出越來越高的要求。批次層析越來越難以滿足生產的需求,而連續層析由多根串聯的層析柱組成,因為第二根柱子可以承接并吸附從第一根層析柱流穿的抗體,因此第一根柱子可以持續上樣到更高的蛋白穿透從而顯著提高層析柱的使用載量,進而提高介質利用率,降低生產成本。連續層析可以極大提高設備的利用率,縮短生產周期,還可以減少緩沖液的消耗。
傳統間歇式層析(左)
新型連續層析工藝(右)
 
 
連續流層析分離過程示意圖
(來源于林東強教授課題組文章)
 
 
UniMab與MabSelectSuRe在批次與連續層析的對比數據
(來源于林東強教授課題組文章)
 
連續層析系統已被認為是下游分離純化的發展必然趨勢,可以大幅度提高抗體下游分離純化效率,降低生產成本。與批次層析相比,連續層析對設備、軟件有更高的要求,而且對介質的要求也不一樣。
 
首先,連續層析由多根串聯的層析柱組成。為了保障產品連續生產的質量,對每根柱子的一致性要求高。因此介質填料均勻性就顯得更為重要,因為介質越均勻,越容易裝柱子,柱效也越高,柱與柱之間的一致性也越好。傳統多分散介質由于顆粒有大有小,在裝柱過程中大小顆粒的沉降速度不同,使得柱與柱之間差異較大;而且小顆粒容易堵塞篩板,影響流速,大顆粒又會降低柱效,也容易使樣品流穿,從而影響分離效率。因此高度粒徑均一的單分散層析介質可以克服傳統多分散介質在連續生產中存在的問題,單分散介質由于粒徑分布均勻可以確保柱與柱的一致性和穩定性。    第二,在連續層析過程中,使用的是串聯的小柱子,為了提高生產效率,線性流速要快,這就對層析介質機械強度要求更高,以滿足高流速下產生的高壓力。目前市場上主流的介質是軟膠,耐壓性差,只能低流速操作。納微新型單分散層析介質由于是高度交聯的介質,因此機械強度高,可滿足高流速的需求。第三,層析介質的實際有效載量與純化效率也有直接的關系,實際有效載量是指介質在實際生產條件尤其是流動相速度下的載量。實際有效載量越高,樣品上樣量可以越大。但線性流速越快,柱保留時間越短,則實際有效載量越低。軟膠雖然在低流速下有較高載量,但在高流速下,載量迅速下降。單分散聚合物層析介質是大孔結構的微球,通透性好,蛋白在微球內的傳遞速度快,因此在高流速下能保持較高的載量。因此粒徑均一(單分散),高機械強度,高流速下保持高載量的介質是連續層析生產的理想的介質。連續層析技術是實現連續生產的關鍵技術。連續生產制藥技術是一種新興技術,雖然還面臨著許多監管的問題和技術的挑戰,但連續生產的優越性卻顯而易見,也是生物制藥工藝發展的趨勢之一。
 
隨著多個重磅原研生物藥的專利到期,為了滿足臨床市場的需求和降低原研生物藥的昂貴醫療費用,越來越多的制藥企業進入生物類似藥的開發領域,這進一步加劇了生物類似藥的競爭,企業成本壓力日益凸顯。抗體的主要成本在于下游的分離純化,而Protein A 親和層析成本占據整個層析分離純化的80%以上,也是下游分離純化的瓶頸,因此,實現Protein A親和層析介質國產化,并通過底層技術創新改善Protein A 機械強度,傳質速度及耐堿性能,開發出新一代單分散Protein A親和層析介質,使其可以在高流速下純化抗體以提高生產效率,降低成本生產。另外機械強度高及傳質快的Protein A 介質又有利于創新連續層析及高柱床的工藝實施,進一步提高抗體的生產效率和降低抗體生產成本,也為中國生物制藥發展實現后發優勢提供支撐。

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